人次級淋巴組織趨化因子定量分析酶聯免疫檢測試劑盒
本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿或細胞培養上清液中的CCL21濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ,請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。
CCL21簡介 :
CCL21 ,也叫SLC(次級淋巴組織趨化因子) 、6Ckine 和 Exodus2 ,與CCL19有32%的同源性 ,與其它CC趨化因子有33%的同源性 。人的CCL21 cDNA編碼134個氨基酸殘基的前體蛋白 ,前體蛋白經過裂解形成成熟的具111個氨基酸的成熟蛋白 。
CCL21一般在淋巴組織如淋巴結 、脾及附屬淋巴器官表麵有大量的表達 。CCL21是幼稚T細胞和樹突狀細胞進入附屬淋巴器官的強烈調控劑 。CCL21也在T細胞的激活中有重要的作用 ,同時具有招募淋巴細胞進入炎性組織的作用 。CCL21被認為是第一個參與體內淋巴細胞歸巢( Lymphocyte homing )的趨化因子 。
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中CCL21的濃度。CCL21捕獲抗體已預包被於酶標板上 ,當加入標本或參考品時 ,其中的CCL21會與捕獲抗體結合 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的抗人CCL21抗體後 ,抗人CCL21抗體與CCL21接合 ,形成夾心的免疫複合物 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ,親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ;其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ,若樣本中存在CCL21將會形成免疫複合物 ,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ,在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ,讀其450nm處的OD值 ,CCL21濃度與OD450值之間呈正比 ,通過參考品繪製標準曲線 ,對照未知樣本中OD值 ,即可算出標本中CCL21濃度 。
人CCL21定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:
組分 | 規格(96T/48T) |
人CCL21預包被板 | 12條/6條 |
樣本分析緩衝液 | 5ml/3ml |
標準品稀釋液 | 10ml/5ml |
人CCL21標準品 | 2支/1支(凍幹) |
人CCL21生物素化抗體 | 10ml/5ml |
親和素連接的HRP酶 | 10ml/5ml |
濃縮洗滌液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5 ml |
中止液 | 5ml/3 ml |
封板膠紙 | 3/2張 |
說明書 | 1份 |
標本收集:
1.標本的收集請按下列流程進行操作 ;
A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ;
B.血清標本應是自然凝固後 ,取上清 ,避免在冰箱中凝固血液 ;
C.血漿標本 ,推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測 ,
D.標本收集後請分裝 ,凍存於-20℃ ,避免反複凍融。
2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ;
3.標本應清澈透明 ,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。
4.請勿使用溶血 ,高血脂或汙染的標本檢測 ,否則結果將不準確 。
注 :人血清或血漿樣本請用樣本分析緩衝液做倍比稀釋後再檢測 。
注意事項:
1.試劑盒請保存在2~8℃ 。
2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ,請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。
3. 標準品複溶加樣後 ,剩餘部份請丟棄 。
4 、底物請勿接觸氧化劑和金屬 。
5 、加樣時 ,請及時更換槍頭 ,避免交叉汙染 。
6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。
7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ,在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。
8.室溫反應 ,請嚴格控製在25~28℃ 。
9.洗滌過程是至關重要的 ,洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。
10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。
11.加樣過程中避免氣泡的產生 。
12 、血清和血漿標本的檢測時 ,檢測抗體的孵育時間應適當延長 。
檢測前準備工作:
1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫(25~28℃)平衡20分鍾;每次檢測後剩餘試劑請及時於2~8℃保存 。
2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。
3.如有5X準品稀釋液 ,請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。
4.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使CCL21終濃度達到4000pg/ml ,室溫反應 ,請嚴格控製在25~28℃ ,靜置15~20分鍾後輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解 ,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。(標準曲線取七個點 ,最高濃度為4000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.)
洗滌方法:
自動洗板機或人工洗板 :每孔洗滌液為300ul ,注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。
實驗過程需自備的材料 :
1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ;
2.酶標儀 ;
3.自動洗板機 ;
4.去離子水或雙蒸水 ;
操作步驟:
1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ,取出所需板條放置在框架內 ,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ,保存於4℃ 。
2.建議設置本底較正孔 ,即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。
3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ,用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25~28℃)孵育120分鍾 。對於血清或血漿標本 ,請加入50 ul樣本分析緩衝液後加50 ul標本 ,如稀釋量大 ,請將樣本與樣本分析緩衝液等量加入 ,不足部分用標準品稀釋液補充至100ul 。
4.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25~28℃)孵育60分鍾 。
6.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,避光室溫(25~28℃)孵育20分鍾 。
8.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ,避光室溫(25~28℃)孵育20分鍾 。
10.加入終止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。
結果判斷:
1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ,複孔的值平均後可作為測量值 。
2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。
3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標 ,以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。
4.若標本OD值高於標準曲線上限 ,應適當稀釋後重測 ,計算濃度時應乘以稀釋倍數 。
典型數值和參考曲線
濃度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.1344 | 0.1423 | 0.1265 |
125 | 0.3426 | 0.3621 | 0.3231 |
250 | 0.5074 | 0.5781 | 0.4367 |
500 | 0.8478 | 0.8728 | 0.8228 |
1000 | 1.2528 | 1.3091 | 1.1965 |
2000 | 1.7522 | 1.7821 | 1.7223 |
4000 | 2.2872 | 2.3519 | 2.2225 |
人 CCL21 參考標準曲線
注意 :本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。
靈敏度 ,特異性和重複性:
1.靈敏度 :多次重複結果表明 ,最小檢出量為54pg/ml 。
2.特異性 :與小鼠 6Ckine等沒有交叉反應 。
3.重複性 :板內 ,板間變異係數均<10%.
參考文獻:
1 、Christopherson,K.W. et al., 2001, Blood. 98 (13):3562-8.
2 、Clark H.F., et al., 2003, Genome Res. 13: 2265-2270.
3 、Ashour,A.E. et al., 2007, Cancer Biol Ther. 6 (8):1206-10.
4 、Mumtaz,M. et al., 2009, Oncol Rep. 21 (1):153-8.