人的成纖維生長因子23定量分析酶聯免疫檢測試劑盒
本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿或細胞培養上清液中的FGF-23 濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ,請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。
FGF-23簡介 :
成纖維生長因子23(FGF-23)屬於FGF家族的成員之一 ,基於其結構 ,可細分為屬於FGF-19亞類 。FGF-23前體有209個氨基酸構成 ,包括28個氨基酸的信號肽 ,FGF-23成熟蛋白有181個氨基酸 。
FGF-23 由肝細胞應對遊離脂肪酸形成的PPARα/RXR二聚體的刺激而產生的。在脂肪組織 ,FGF-23可與PPARγ協同作用增加葡萄糖載體GLUT1 ,從而使葡萄糖水平升高 。FGF-23 還參與了許多其它的生理過程 ,包括胚胎發育 、細胞生長 、形態發生 、組織修複 、腫瘤生長與侵襲等 。
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中FGF-23的濃度 。FGF-23捕獲抗體已預包被於酶標板上 ,當加入標本或參考品時 ,其中的FGF-23會與捕獲抗體結合 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的FGF-23抗體後 ,抗FGF-23抗體與FGF-23接合 ,形成夾心的免疫複合物 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ,親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ;其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ,若樣本中存在FGF-23將會形成免疫複合物 ,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ,在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ,讀其450nm處的OD值 ,FGF-23濃度與OD450值之間呈正比 ,通過參考品繪製標準曲線 ,對照未知樣本中OD值 ,即可算出標本中FGF-23濃度 。
FGF-23定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:
組分 | 規格(96T/48T) |
FGF-23預包被板 | 12條/6條 |
5×標準品稀釋液 | 10ml/5ml |
FGF-23標準品 | 2支/1支(凍幹) |
FGF-23生物素化抗體 | 10ml/5ml |
親和素連接的HRP酶 | 10ml/5ml |
濃縮洗滌液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板膠紙 | 3/2張 |
說明書 | 1份 |
標本收集:
1.標本的收集請按下列流程進行操作 ;
A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ;
B.血清標本應是自然凝固後 ,取上清 ,避免在冰箱中凝固血液 ;
C.血漿標本 ,推薦用EDTA的方法收集 ;
D.若待測樣本不能及時檢測 ,標本收集後請分裝 ,凍存於-20℃ ,避免反複凍融 。
2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ;
3.標本應清澈透明 ,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。
4.請勿使用溶血 ,高血脂或汙染的標本檢測 ,否則結果將不準確 。
注意事項:
1.試劑盒請保存在2~8℃ 。
2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ,請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。
3.標準品複溶加樣後 ,剩餘部份請丟棄 。
4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。
5.加樣時 ,請及時更換槍頭 ,避免交叉汙染 。
6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。
7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ,在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。
8.室溫反應 ,請嚴格控製在25-28℃ 。
9.洗滌過程是至關重要的 ,洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。
10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。
11.加樣過程中避免氣泡的產生 。
12.血清和血漿標本的檢測時 ,檢測抗體的孵育時間應適當延長
檢測前準備工作:
1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫(25-28℃)平衡20分鍾 ;每次檢測後剩餘試劑請及時於2~8℃保存 。
2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。
3.如有5X準品稀釋液 ,請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。
4.標準品: 按標簽複溶體積加入1X標準品稀釋液複溶使FGF-23終濃度達到5000pg/ml ,室溫反應 ,請嚴格控製在25~28℃ ,靜置15~20分鍾後輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解 ,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。(標準曲線取七個點 ,最高濃度為5000pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0 濃度.)
洗滌方法:
自動洗板機或人工洗板 :每孔洗滌液為300ul ,注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。
實驗過程需自備的材料 :
1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ;
2.酶標儀 ;
3.自動洗板機 ;
4.去離子水或雙蒸水;
操作步驟:
1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ,取出所需板條放置在框架內 ,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ,保存於4℃ 。
2.建議設置本底較正孔 ,即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。
3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ,用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25-28℃)孵育120分鍾 。不同樣本中PAI-1含量不一樣 ,試劑盒用來檢測血清樣本的稀釋倍數一般2~30倍稀釋 ,如果無明確範圍 ,需提前預實驗 ,如果超出檢測範圍 ,應用標準品稀釋液稀釋後重新檢測 。
4.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25-28℃)孵育60分鍾 。
6.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,避光室溫(25-28℃)孵育20分鍾 。
8.洗板7次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ,避光室溫(25-28℃)孵育20分鍾 。
10.加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。
結果判斷:
1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ,複孔的值平均後可作為測量值 。
2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。
3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ,OD值作縱坐標 ,以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。
4.若標本OD值高於標準曲線上限 ,應適當稀釋後重測 ,計算濃度時應乘以稀釋倍數 。
典型數值和參考曲線
濃度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.082 | 0.106 | 0.094 |
156.25 | 0.219 | 0.287 | 0.253 |
312.5 | 0.421 | 0.485 | 0.453 |
625 | 0.689 | 0.761 | 0.725 |
1250 | 1.005 | 1.083 | 1.044 |
2500 | 1.46 | 1.512 | 1.486 |
5000 | 1.998 | 2.226 | 2.112 |
FGF-23參考標準曲線
注意 :本圖僅供參考 ,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。
靈敏度,特異性和重複性:
1.靈敏度 :多次重複結果表明 ,最小檢出量為42.5pg/ml 。
2.特異性 :與人的FGF R1α 、FGF R2α 、FGF R3 、FGF R4無交叉反應性 ,與小鼠的FGF-23有0.5%的交叉反應性 。
3.重複性 :板內 ,板間變異係數均<10%.
參考文獻:
1. Huang, X. et al. (2006) Mol. Carcinog. 45:934.
2. Urakawa, I. et al. (2006) Nature 444:770.
3. Kurosu, H. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:26687.
4. Mohammadi, M. et al. (2005) Cytokine Growth Factor Rev. 16:107.
5. Shimada, T. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6500.
6. Moore, D.D. (2007) Science 316:1436.
貨號 | 產品名稱 | 規格 | 價格 | 指令 |
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