人表皮生長因子定量分析酶聯

免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清血漿樣本 、唾液或細胞培養上清液中的EGF 濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整.如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

EGF簡介 ：

表皮生長因子(EGF)是屬於表皮生長因子家族的成員 ，表皮生長因子家族的成員除了表皮生長因子之外 ，還包括β細胞素(betacelluin) 、 雙調蛋白(Amphiregulin) 、肝素結合樣表皮生長因子(HB-EGF) 、表皮調節素(Epiregulin) 、轉化生長因子阿爾法（TGF­α） 、epigen 、神經調節素1-6(neuregulins)等 。EGF是一個隻有53個氨基酸的小分子蛋白質 ，像其它表皮生長因子家族成員一樣 ，含有三個二硫鍵的特征結構 。

EGF在細胞生長 ，腫瘤的形成和療傷等生理過程中均有重要作用。體外和體內的實驗表明 ，EGF可刺激各種表皮和上皮組織的生長 。在體外細胞的培養中 ，EGF被觀察到對某些成纖維細胞 、腎上皮細胞 、神經膠質細胞 、卵巢顆粒細胞和甲狀腺細胞等具有刺激生長的作用 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中表皮生長因子的濃度 。表皮生長因子捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的表皮生長因子會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的表皮生長因子抗體後 ，抗表皮生長因子抗體與表皮生長因子接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ，親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ；其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在表皮生長因子將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，表皮生長因子濃度與OD450值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中表皮生長因子濃度 。

EGF定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集 ；

D.若待測樣本不能及時檢測 ，標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除

4.請勿使用溶血 ，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25-28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

12.血清標本的檢測時 ，檢測抗體的孵育時間應適當延長幾分鍾 。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25-28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3. 將5×標準品稀釋液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水) 。

4.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使EGF終濃度達到250pg/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置15~20分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為250pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0 濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育120分鍾 。血清樣本稀釋範圍1~5倍 ，如無明確範圍 ，建議3倍稀釋後檢測 。不能檢測血漿樣本 ，唾液檢測稀釋範圍1~40倍 ，如無明確範圍 ，建議10倍稀釋後檢測 。

4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育60分鍾 。   

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

8.洗板7次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

10.加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數 。

典型數值和參考曲線

EGF參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為2.5pg/ml 。

2.特異性 ：與人的EGF R,,HB-EGF ,TGF-α,TNF-α及小鼠的EGF無交叉反應性 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

1. Parries, G. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:27954

2. Jo, M. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:8806.   

3. Harris, R.C. et al. (2003) Exp. Cell Res. 284:2.

4. Burgess, A.W. et al. (2003) Mol. Cell 12:541.

5. Kwan, R. et al. (1999) Int. J. Oncol. 15:281.

6. Aybay, C. et al. (2006) Cytokine 35:36.

ELISA Kit for the Quantitative Analysis of Human EGF

The human EGF ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit is used for detection of human EGF in cell culture supernatants,human serum and saliva.THE ELISA KIT IS FOR RESEARCH USE ONLY.Please read this instruction manual carefully and check out the material provided before use,  

and you can contact with our company if any questions. You can enter our website or call us for other aim.

Introduction

Epidermal growth factor (EGF) is the member of the EGF family which includes betacellulin (BTC), amphiregulin (AR), heparinbinding EGF­like growth factor (HB­EGF) ,epiregulin (EPR), TGF­α, , epigen and the neuregulins (NRG)­1 through ­6 (1). EGF is a small 53 amino acid residue long protein that contains a structural motif, the EGF­like domain of which have three disulfide bridges.

EGF is involved in mechanisms such as normal cell growth, oncogenesis, and wound healing. EGF stimulates the growth of various epidermal and epithelial tissues in vivo and in vitro. EGF stimulates the growth some fibroblasts, kidney epithelial cells, human glial cells, ovary granulosa cells, and thyroid cells in cell culture.

EGF was first purified from the mouse submandibular gland, but since then it was found in many human tissues including 

submandibular gland, parotid gland. It can also be found in human platelets, macrophages, urine, saliva, milk, and plasma.

Principles of the Test

The kits is a solid sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of EGF. An anti-human EGF monoclonal antibody has been absorbed onto the wells of the microtiter strips provided. Samples including specimens or standards were pipetted into wells. The EGF in specimens or standards would be captured by the coated antibody and the free others were removed by washing. The human EGF biotin- conjugated antibody were added and binds to EGF captured by the first antibody, which formed a sandwich. Streptavidin-HRP would be added and binds to the biotin conjugated antibody, then free Streptavidin-HRP would be removed during a wash step. After this, subtrate solution would be added and catalyzed by the HRP, and a coloured product is formed.The intensity of the colored product is used to calculate in proportion to the amount of human EGF in the original specimen..