大鼠白細胞介素4定量分析酶聯免疫檢測試劑盒
本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測大鼠血清 、血漿或細胞培養上清液中的IL-4濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整,如有產品包裝破損或質量投拆 ,請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。
IL-4簡介 :
白介素4(IL-4)是一種多功能細胞因子 ,主要是由激活的T淋巴細胞 、肥大細胞與骨髓基質細胞表達 。IL-4因為糖基化的不同,分子量從15到19kDa不等 。
IL-4可以對多種細胞起到調節免疫反應功能的作用 。白細胞介素4參與多種B-細胞等此類細胞的激活過程 ,是DNA合成的協同刺激分子 ,它能誘導靜息B細胞上II 型MHC (主要組織相容複合體)分子的表達 。能增強IgE與 IgG1的分泌以及在細胞表麵的表達 ,還可以調節淋巴細胞和單核細胞上對IgE低親和Fc受體的表達 。IL-4在抗體亞型轉換中也起到重要的調節作用 ,是T輔助前體細胞向Th2細胞分化的重要調節因子 ,從而間接調節體液免疫以及抗體的生成 。此外 ,白細胞介素4基因在機體中的的遺傳變異可導致缺血性中風易感性提高 ,腦血管意外或腦梗塞等疾病 。
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中大鼠IL-4的濃度 。大鼠IL-4捕獲抗體已預包被於酶標板上 ,當加入標本或參考品時 ,其中的大鼠IL-4會與捕獲抗體結合 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的抗大鼠IL-4抗體後 ,抗大鼠IL-4抗體與大鼠IL-4接合 ,形成夾心的免疫複合物 ,其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ,親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ;其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ,若樣本中存在IL-4將會形成免疫複合物 ,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ,在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ,讀其450nm處的OD值 ,大鼠IL-4濃度與OD450值之間呈正比 ,通過參考品繪製標準曲線 ,對照未知樣本中OD值 ,即可算出標本中IL-4濃度 。
大鼠IL-4定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:
組分 | 規格(96T/48T) |
大鼠IL-4預包被板 | 12條/6條 |
樣本分析緩衝液 | 5ml/3ml |
標準品稀釋液 | 10ml/5ml |
大鼠IL-4標準品 | 4/2支(凍幹) |
大鼠IL-4生物素化抗體 | 10ml/5ml |
親和素連接的HRP酶 | 10ml/5ml |
濃縮洗滌液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板膠紙 | 3/2張 |
說明書 | 1份 |
標本收集:
1.標本的收集請按下列流程進行操作 ;
A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可;
B.血清標本應是自然凝固後 ,取上清 ,避免在冰箱中凝固血液 ;
C.血漿標本 ,推薦用EDTA的方法收集 ;
D.若待測樣本不能及時檢測 ,標本收集後請分裝 ,凍存於-20℃ ,避免反複凍融 。
2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ;
3.標本應清澈透明 ,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。
4.請勿使用溶血 ,高血脂或汙染的標本檢測 ,否則結果將不準確 。
注 :大鼠血清或血漿樣本請用樣本分析緩衝液做倍比稀釋後再檢測 。
注意事項:
1.試劑盒請保存在2~8℃ 。
2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ,請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。
3.標準品複溶加樣後 ,剩餘部份請丟棄 。
4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。
5.加樣時 ,請及時更換槍頭 ,避免交叉汙染 。
6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。
7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ,在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。
8.室溫反應 ,請嚴格控製在25~28℃ 。
9.洗滌過程是至關重要的 ,洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。
10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。
11.加樣過程中避免氣泡的產生 。
12.血清和血漿標本的檢測時 ,檢測抗體的孵育時間應適當延長 。
檢測前準備工作:
1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫(25~28℃)平衡20分鍾 ;每次檢測後剩餘試劑請及時於2~8℃保存 。
2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。
3.如有5X準品稀釋液 ,請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。
4.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使IL-4終濃度達到1000pg/ml ,室溫反應 ,請嚴格控製在25~28℃ ,靜置10~15分鍾後輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解 ,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。(標準曲線取七個點 ,最高濃度為1000 pg/m l,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.)
洗滌方法:
自動洗板機或人工洗板 :每孔洗滌液為300ul ,注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。
實驗過程需自備的材料 :
1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ;
2.酶標儀 ;
3.自動洗板機 ;
4.去離子水或雙蒸水 ;
操作步驟:
1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ,取出所需板條放置在框架內 ,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ,保存於4℃ 。
2.建議設置本底較正孔 ,即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。
3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ,用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25~28℃)孵育120分鍾 。對於血清或血漿標本 ,請加入50 ul樣本分析緩衝液後加50 ul標本 ,如稀釋量大 ,請將樣本與樣本分析緩衝液等量加入 ,不足部分用標準品稀釋液補充至100ul 。
4.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,室溫(25~28℃)孵育60分鍾 。
6.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹。
7.加入親和素鏈接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ,避光室溫(25~28℃)孵育20分鍾 。
8.洗板5次 ,且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。
9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ,避光室溫(25~28℃)孵育20分鍾 。
10.加入終止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。
結果判斷:
1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ,複孔的值平均後可作為測量值 。
2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。
3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ,OD值作縱坐標 ,以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。
4.若標本OD值高於標準曲線上限 ,應適當稀釋後重測 ,計算濃度時應乘以稀釋倍數 。
典型數值和參考曲線
濃度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.0965 | 0.1293 | 0.1129 |
31.25 | 0.2873 | 0.2223 | 0.2548 |
62.5 | 0.3789 | 0.4019 | 0.3904 |
125 | 0.6921 | 0.6195 | 0.6558 |
250 | 1.0958 | 0.9952 | 1.0455 |
500 | 1.3597 | 1.5365 | 1.4481 |
1000 | 2.0691 | 1.9981 | 2.0336 |
大鼠IL-4參考標準曲線
注意 :本圖僅供參考 ,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。
靈敏度 ,特異性和重複性:
1.靈敏度 :多次重複結果表明 ,最小檢出量為16pg/ml 。
2.特異性 :與GDNF,GM-CSF,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-6,IL-10,PDGF-BB,TNF-α,human IL-4, mouse IL-4
等沒有交叉反應 。
3.重複性 :板內 ,板間變異係數均<10%.
參考文獻:
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