小鼠瘦素定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養上清液中的Leptin濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

Leptin簡介 ：

小鼠瘦素蛋白是一個146個氨基酸的多肽激素 ，主要由脂肪細胞釋放 ，其主要作用是調控食欲的降低和能量消耗 。但是 ，人們還發現瘦素蛋白在血管再生 、骨代謝 、造血及免疫調節上有重要的作用 。瘦素可與丘腦下部的中央脊腹部的飽覺中樞結合 ，從而使得大腦得到食物充足的信號 ，這樣瘦素的表達水平的高低就可達到調控能量攝入和機體的能量消耗作用 。瘦素功能的實現主要跟瘦素受體結合後實現的 ，瘦素受體有兩類 ，一類是固定細胞膜上的受體 ，主要通過JAK/STAT信號通路起作用 ，另一類是遊離的受體 ，這類受體一般是丟失了受體的細胞膜內的部分 ，遊離出來的 ，根據失去的結構不同 ，遊離受體的種類較多 。人體內遊離的受體的產生主要是由金屬蛋白酶介導的細胞膜外功能域的脫落後形成的 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中小鼠Leptin 的濃度 。小鼠Leptin 捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的小鼠Leptin 會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的抗小鼠Leptin 抗體後 ，抗小鼠Leptin 抗體與小鼠Leptin 接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ，親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ；其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在小鼠Leptin 將會形成免疫複合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，Leptin 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中Leptin 濃度 。

小鼠Leptin定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集 ；

D.若待測樣本不能及時檢測 ，標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。

4.請勿使用溶血高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注 ：小鼠血清或血漿樣本請使用樣本分析緩衝液 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後 ，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

12.血清和血漿標本的檢測時 ，檢測抗體的孵育時間應適當延長 。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25-28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3.如有5X標準品稀釋液 ，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。

4.標準品: 按標簽複溶體積加入1X標準品稀釋液複溶使小鼠leptin終濃度達到8000pg/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置15~20分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為8000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育120分鍾 。如果是血清血漿樣本 ，不同樣本稀釋比例不一樣 ，一般範圍在1.25~10倍 ，如無明確範圍 ，建議從2倍開始 ，加樣稀釋說明如下 ：每孔先加樣本分析緩衝液50ul ，再加用1×標準品稀釋液稀釋後的樣本 ，加樣量為50ul 。

4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育60分鍾 。    

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

8.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

10.加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數.

典型數值和參考曲線

小鼠Leptin參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為134.6pg/ml 。

2.特異性 ：與人G-CSF 、GM-CSF 、IFN-γ 、IL-1α 、IL-1β 、IL-2 、IL-4 、IL-6等沒有交叉反應 。與大鼠lepin有40%交叉反應 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

1. Masuzaki, H. et al. 1997 J. Clin. Endocrin. and Metabolism 82:2542.

2. Coleman, D.L. (1978) Diabetologia 14:141.

3. Houseknecht, K.L. et al. (1996) Diabetes 45:638.

4. Chen, H. et al. (1996) Cell 84:491.

5. Pagano, C. et al. (1997) Int. J. Obesity 21:614.

6. Lee, G.H. et al. (1996) Nature 379:632.