小鼠IL-18定量分析酶聯免疫

檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測小鼠血清 、血漿或細胞培養上清液中的IL-1O濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

IL-18簡介 ：

白介18（IL-18）是一個18 kDa的細胞因子 ，結構上與IL-1極其相似 ，對T細胞的活化有重要影響 。IL-18的前體缺少信號肽 ，前體由IL-1beta轉換酶（ICE）裂解為成熟的IL-18 。

有報道稱IL-18由下列細胞產生 ：樹突狀細胞 、活化的巨噬細胞 、凱夫勒細胞 、角化細胞 、腸內皮細胞 、格根包爾氏細胞 、腎上腺皮質細胞等 。其中有報道稱人的角化細胞是IL-18的主要產生源 。

IL-18對T輔助細胞起作用 ，其效果是與IL-12協同強烈刺激T輔助細胞產生IFN-γ 。當然 ，IL-18也有許多其它的效用 ，包括刺激外周血中由單核細胞產生IFN-γ 和 GM-CSF水平的升高 ，刺激T細胞產生Th1類的細胞因子如IL-2 、IFN-γ 和GM-CSF等 ，提高Th1類的細胞表麵的Fas配體的表達 。此外 ，在治療腫瘤 、感染和自身免疫方麵 ，IL-18也是一個重要的預後指標 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-18的濃度 。IL-18捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的IL-18會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IL-18抗體後 ，抗小鼠IL-18抗體與小鼠IL-18接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在小鼠IL-18蛋白將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，小鼠IL-18濃度與OD450值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中小鼠IL-18濃度 。

小鼠IL-18定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測 ，

D.標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。

4.請勿使用溶血 ，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注:樣本如需稀釋請用標準品稀釋液稀釋後再檢測 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後 ，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

樣本的稀釋:

1. 血清或血漿樣本5~30倍稀釋 ，不同樣本含量不一樣 ，檢測前需預實驗 ，如無明確範圍 ，可從5倍開始 。

2.細胞上清及尿樣本稀釋倍數根據預實驗確定 ；

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25～28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3.將5×標準品稀釋液用去離子水或雙蒸水按1:4稀釋成所需的體積 ；

4.將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鍾配製成工作濃度 ；

5.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使IL-18終濃度達到1500pg/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置10~15分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為100ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）下圖為標準品稀釋示意圖 。

洗滌方法:

自動洗板機或小鼠工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25～28℃）孵育120分鍾 。    

4.洗板3次（重要提示 ，一定是三次） ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25～28℃）孵育60分鍾 。    

6.洗板3次（重要提示 ，一定是三次） ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7. 加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25～28℃）孵育20分鍾 。

8. 加入終止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD₄₅₀值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數

典型數值和參考曲線

小鼠IL-18參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為16.8ng/ml 。

2.特異性 ：與小鼠的IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 p70, IL-13, IL-17及人IL-18等沒有交叉反應 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

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