細胞凍存液的配方是什麽

細胞深低溫保存的基本原理是 ：在－70℃以下時 ，細胞內的酶活性均己停止 ，即代謝處於完全停止狀態 ，故可以長期保存 。細胞低溫保存的關鍵 ，在於通過0~20℃階段的處理過程 。在此溫度範圍內 ，水晶呈針狀 ，極易招致細胞的嚴重損傷 。 總的原則是緩慢凍存 ！ ！ ！
一 材料 ：

生長良好之培養細胞 ，新鮮培養基 ，  DMSO  ，無菌塑料冷凍保存管 ，血球計數盤與蓋玻片  。

二步驟 ：

2.1 冷凍前一日前更換半量或全量培養基 ，觀察細胞生長情形,最好細胞應該處於對數生長期 。
2.2. 配製冷凍保存溶液(使用前配製) ：將DMSO 加入新鮮培養基中 ，最後濃度為5-10％ ，混合均勻 ，置於室溫下待用 。 
2.3. 依細胞傳代培養之操作 ，收集培養之細胞與凍存管內 ，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度 。 

2.4. 先將凍存管放入4℃冰箱 ，約40min 。

2.5 接著置於-20℃冰箱 ，約30-60min 。

2.6. 置於-80超低溫冰箱中放置過夜 。

2.7. 置於液氮罐中長期保存。

2.8 同時做好凍存記錄 ，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄 。

三 注意事項 ：

3.1.使用DMSO前 ，不需要進行高壓滅菌 ，它本身就有滅菌的作用 。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構 ，以至於降低冷凍保護效果 。

在常溫下 ，DMSO對人體有害 ，故在配製時最好戴上手套操作 。

混合DMSO要快 ，因為DMSO對細胞有毒性 ，混合之後應盡快凍存 ，提醒各位注意的是加入凍存液後一定要混勻 ，防止DMSO沉澱 。

凍存液比例培養基7 ：血清2 ：DMSO1 ，也有將血清比例加大的做法 ，有的甚至將血清提高到90% ，具體濃度視經驗而定 ，但是好多人認為胎牛血清含量越高越好 ！

常用的細胞凍存液配方為 ：

    20％血清（FBS） 、10％DMSO 、70％培養基 ；

    或90％血清（FBS） 、10％DMSO ，更可防止細胞內冰晶形成 。

3.2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度範圍內過久 ，低溫損傷主要發生在這一溫度區內 ，是“危險溫區” 。 

可以先在泡沫上打孔 ，把凍存管塞進去 。這樣降溫可以慢一點 ，當然包上棉花也是不錯的主意

3.3.注意定期檢查液氮罐內液氮量 ，及時添加 。

3.4  -20°C 不可超過 1 小時 ，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡 。

3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml 以上 ，凍存細胞健康程度 一般要求活細胞在95%以上 ，細胞活力差的在凍存後的成活機率很小 ，因此 ，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存
3.6 細胞凍存管一般有1.5-2ml左右體積 ，原則上可以存放1.5ml充滿均勻懸浮細胞的凍存液 ，一些人喜歡灌注1-1.5ml凍存液凍存 ，這實際上並不好 。

原因如下 ：凍存液凍存需要一段時間 ，如果這段時間凍存管傾斜 ，液體容易流到管口 ，很容易在後續的操作中造成汙染 。

建議0.5-1ml之間即可 。但是還是用1.5ml的話 ，具體操作時 ，凍存管直立起來放在-20的冰箱裏 ，這樣不容易造成汙染 。
同時凍存細胞的時候 ，一定加上封口膜 ，這樣可以避免複蘇的時候 ，水浴箱裏的水進入蓋子的縫隙中 ！

凍存管外麵用封口膜封上後 ，最好再用白膠布再封一下 。

這樣可以防止細胞複蘇時 ，封口膜崩裂 ，水浴箱中的水進入凍存管 。

3.7 提醒;不要將細胞凍存在-4度 ，或－20時就忘了 ，很心疼 。

小秋建議使用HAKATA無血清細胞凍存液 ，無需程序降溫 ，直凍-80°C冰箱 ，可長期保存達5年 。   

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