細胞計數
實驗原理 :當待測細胞懸液中細胞均勻分布時 ,通過測定一定體積懸液中的細胞的數目 ,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目 。
具體操作 :
一.準備工作 :
取一瓶傳代的細胞 ,按照《傳代細胞培養(消化法)》中的傳代方法繁殖細胞 ,待長成單層後以被使用 。
二.細胞懸液製備 :
細胞懸液的製備方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化 、PBS液洗滌後 ,加入培養液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液) ,吹打製成待測細胞懸液 。
三.細胞計數 :
1.蓋好蓋玻片 :取一套血球計數板 ,將特製的蓋玻片蓋在血球計數槽上 。
2.製備計數用的細胞懸液 :用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中 ,加入5滴台盼藍染液(0.4%)或苯胺黑 ,活細胞不會被染色 ,加入染液後就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞 。
3.將細胞懸液滴入計數板 :將待測細胞懸液吹均勻 ,然後吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入 ,要保證蓋片下充滿懸液 ,注意蓋片下不要有氣泡 ,也不能讓懸液流入旁邊槽中 。
4.統計四個大格的細胞數 :將血球計數板放於顯微鏡的低倍鏡下觀察 ,並移動計數板 ,當看到鏡中出現計數方格後 ,數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數目 。
5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下麵公式計算細胞密度 :
(細胞懸液的細胞數)/ml= ( 四個大格子細胞數/4) ×2×104
說明 :公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數 。
公式中乘以2因為細胞懸液於染液是1 :1稀釋 。
公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為 :
1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
四.細胞計數要點 :
1.進行細胞計數時 ,要求懸液中細胞數目不低於104個/ml ,如果細胞數目很少要進行離心再懸浮於少量培養液中 ;
2.要求細胞懸液中的細胞分散良好 ,否則影響計數準確性 。
3.取樣計數前 ,應充分混勻細胞懸液 ,尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻 ,以求計數準確 ;
4. 數細胞的原則是隻數完整的細胞,若細胞聚集成團時 ,隻按照一個細胞計算 。如果細胞壓在格線上時 ,則隻計上線 ,不計下線 ,隻計右線 ,不計左線 。
5. 操作時 ,注意蓋片下不能有氣泡 ,也不能讓懸液流入旁邊槽中 ,否則要重新計數 。
五.初學者易犯的錯誤 :
1. 計數前未將待測懸液吹打均勻 。
2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡 。
3. 滴入懸液時的量太多 ,至使細胞懸液流入旁邊的槽中 。
六.本實驗特殊試劑的配製 :
4%台盼藍母液 :稱取4克台盼藍 ,加入少量蒸餾水研磨 ,加雙蒸水至100毫升 ,用濾紙過濾 ,4℃保存 。
使用液 :使用時 ,用PBS稀釋母液至0.4%即可 。