器材與試劑：

幹粉型培養基 、胰蛋白酶 ，青黴素 、鏈黴素. 純淨水係統 、電子天平 、PH計 、磁力攪拌器 。

具體步驟 ：

一.  水的製備 ：

細胞培養用水必須非常純淨 ，不含有離子和其他的雜質 。需要用新鮮的雙蒸水 、三蒸水或純淨水

二.PBS的製備與消毒(也可用於其它BSS ，如 ：Hanks ，D-Hanks液的配製) ：

1.溶解定容 ：將藥品（NaCl 8.0g ，KCl 0.2g ，Na₂HPO_4·H₂O 1.56g ，KH₂PO₄ 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中 ，玻璃棒攪動 ，充分溶解 ，然後把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配製的PBS溶液 。

2.移入溶液瓶內待消毒 ：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽 ，並插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鍾 。注意高壓消毒後要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份 。 

三. 胰蛋白酶溶液的配製與消毒 ：

   胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散 。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣 。胰酶分散細胞的活性還與其濃度 、溫度和作用時間有關 ，在pH為8.0 、溫度為37℃時 ，胰酶溶液的作用能力最強 。使用胰酶時，應把握好濃度 、溫度和時間 ，以免消化過度造成細胞損傷 。因Ca2+ 、Mg2+和血清 、蛋白質克降低胰酶的活性 ，所以配製胰酶溶液時應選用不含Ca2+ 、Mg2+的BSS ，如 ：D-Hanks液 。終止消化時 ，可用含有血清培養液或者胰酶抑製劑終止胰酶對細胞的作用 。

1.稱取胰蛋白酶 ：按胰蛋白酶液濃度為0.25％ ，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中 。攪拌混勻 ，置於4℃內過夜 。

2.用注射濾器抽濾消毒 ：配好的胰酶溶液要在超淨台內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌 。然後分裝成小瓶於-20℃保存以備使用 。

四.青 、鏈黴素溶液的配製於消毒

1.     所用純淨水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鍾滅菌。

2.具體操作均在超淨台內完成 。青黴素是80萬單位/瓶 ，用注射器加4ml滅菌雙蒸水 。鏈黴素是100萬單位/瓶 ，加5ml滅菌雙蒸水 ，即每毫升各為20萬單位 。

3.使用時溶入培養液中 ，使青鏈黴素的濃度最終為100單位/ml 。1單位＝1微克 ？

五.RPMI1640的製備與消毒 ：

1.溶解 、調PH值 、定容 ：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中,並用雙蒸水衝洗包裝袋2-3次(衝洗液一並加入培養基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,並按照包裝說明添加一定的藥品.然後用注射器向培養基中加入配製好的青鏈黴素液各0.5ml, 使青鏈黴素的濃度最終各為100單位/ml 。然後用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右 。最後定容至1000ml ，搖勻 。

2.安裝蔡式濾器 ：安裝時先裝好支架 ，按規定放好濾膜 ，用螺絲將不鏽鋼濾器和支架連接好 。然後卸下支架腿分別用布包好待消毒 。

3.抽濾 ：配製好的培養液通常用濾器過濾除菌 。通常用蔡式濾器在超淨工作台內過濾 。

4.分裝 ：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置於4℃冰箱內待用 。

5.使用前要向100ml培養液中加入1ml穀氨酰胺溶液（4℃時兩周有效） 。

六．血清的滅火 ：

細胞培養常用的是小牛血清 ，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鍾後 ，再經過抽濾方可加入培養基中使用 。

七.HEPES溶液 ：

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ） 。對細胞無毒性作用 。它是一種氫離子緩衝劑 ，能較長時間控製恒定的pH範圍 。使用終濃度為10-50mmol/L ，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩衝能力 。

1mol/L HEPE緩衝液配製方法如下 ：

準確稱取HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至1L 。過濾除菌 ，分裝後4℃保存 。

注意 ：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶 ，所以可根據實際情況靈活配製，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L  。如 ：稱取4.766克HEPES溶於20ml三蒸水中 ，過濾除菌後可完全（20ml）加入1L培養液中 ，或者每100ml培養液中加入2ml即可 。

八.穀氨酰胺 ：

合成培養基中都含有較大量的穀氨酰胺 ，其作用非常重要，細胞需要穀氨酰胺合成核酸和蛋白質 ，穀氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡 。在配製各種培養液中都應該補加一定量的穀氨酰胺 。由於穀氨酰胺在溶液中很不穩定 ，4℃下放置1周可分解50％ ，故應單獨配製 ，置於-20℃冰箱中保存 ，用前加入培養液 。加有穀氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時 ，應重新加入原來的穀氨酰胺 。

一般培養液中穀氨酰胺的含量為1～4mmol/L 。可以配製200mmol/L穀氨酰胺液貯存 ，用時加入培養液 。配製方法為 ，穀氨酰胺2.922g溶於三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液 ，充分攪拌溶解後 ，過濾除菌 ，分裝小瓶 ，-20℃保存 ，使用時可向100ml培養液中加入1ml穀氨酰胺溶液 。

九.肝素溶液的配製 ：

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高 ，肝素加入全培養液中最終濃度為50ug/ml 。因為現在市售的多為肝素鈉 ，包裝為約為0.56克/瓶 ，配製時 ，可將其溶於100ml三蒸水中 ，定容 ，過夜 ，然後過濾除菌 ，分裝小瓶 ，保存溫度為  ℃  。使用時 ，向100ml培養液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可 。

十. Ⅰ型膠原酶 ：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製和消毒滅菌 。注意 ：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾 ，因此可以用蔡式濾器過濾除菌 。分裝入10ml小瓶-20℃保存 。

十一.明膠溶液 ：

因為明膠難於過濾 ，所以配製0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配製 。所以製備過程中必須要注意無菌操作 。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題 。其次要注意即使是01.的溶液 ，明膠也難溶 ，因此要充分搖勻 ，過夜放置 ，然後無菌分裝入50ml小瓶中 ，4℃保存 。

其他培養用液的配製 ： 

20ug/ml內皮生長因子 ，

注意事項 ：

1.配製溶液時必須用新鮮的蒸餾水 。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張 ，放置位置為0.45的位於0.22微米的濾膜上方 ，並且要特別注意濾膜光麵朝上。

3.配製RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清 ，而小牛血清略偏酸性 ，為了保證培養液PH值最終為7.2 ，可在配製時調PH至7.4 。