細胞凍存液常用比例

1. 在冷凍保存前立即檢查您的細胞培養物是否有細菌 ，真菌 ，支原體和病毒汙染 。在大多數情況下 ，汙染篩選的結果將在培養物冷凍保存（10至14天）後的一段時間內獲得 。

2. 製備由完全培養基和5％DMSO組成的細胞凍存液 。不要將未稀釋的DMSO加入細胞懸浮液中 ，因為DMSO在水溶液中的溶解會釋放出熱量（放熱） 。

3. 通過溫和離心（125xg ，10分鍾）收集細胞 ，並將它們以1×10 6至5×10 6活細胞/ ml的濃度重懸於細胞凍存液中 。繼續維持培養細胞直至確認回收細胞的存活率（參見步驟9） 。

4. 使用細胞係的名稱和日期標記適當數量的樣品瓶 。然後向每個小瓶中加入1至1.8ml細胞懸浮液（取決於小瓶的體積）並密封。

5. 讓細胞在室溫下在細胞凍存液中平衡至少15分鍾但不超過60分鍾 。這個時間通常用於將細胞懸浮液的等分試樣分配到小瓶中 。60分鍾後 ，由於DMSO ，細胞活力可能下降 。

6. 使用梯度降溫 ，或者 ，使用可編程的冷凍裝置以每分鍾-1℃的速度冷卻冷凍瓶 ，直至達到-70℃以下的溫度。（推薦使用HAKATA無血清細胞凍存液 ，可直凍-80°C）

7. 將樣品瓶快速轉移至液氮或-80°C冰箱 。冷凍材料將以每分鍾10°C的速度升溫 ，如果溫度高於-50°C ，會迅速變質 。

8. 記錄凍結的位置和詳細信息 。

9. 在-180℃下24小時後 ，取出一個冷凍小瓶 ，恢複培養中的細胞 ，並確定它們的活力和無菌性 。