懸浮細胞

材料 ：

對於細胞凍存

對數晚期的75 cm2 T型細胞瓶（約40 mL / T瓶）

細胞凍存液（通常含有10％二甲基亞碸 ，DMSO）

標記的低溫小瓶（對數晚期每40 mL體積的細胞約5個）

對於解凍

冷組織培養基

25平方厘米的T型燒瓶

細胞凍存程序 ：

預凍存

1）在顯微鏡下檢查細菌 ，酵母或真菌汙染 。

2）測試支原體樣品 。

3）當細胞達到對數晚期時 ，使用Coulter計數器確定細胞密度 。計算燒瓶中的細胞總數 ，並確定所需的細胞凍存液的量 。 （細胞應重懸於5,000,000至20,000,000細胞/ mL的冷凍培養基中 。）

凍結

4）將細胞在50mL Falcon管中以1000g離心15分鍾 。

5）當細胞旋轉時 ，製備細胞凍存液（例如 ，90％FBS ，10％DMSO） 。標記低溫小瓶 ，包括日期 ，細胞類型和用戶首字母 。

6）從離心細胞中吸走上清液並加入細胞凍存液 。研磨細胞直至均勻 。

7）每個低溫小瓶快速分裝1 mL細胞凍存液。擰緊每個小瓶 。

8）將小瓶放入儲存盒並將用紙巾絕緣的盒子放入Tupperware®容器中 。將整個容器放入-20°C冰箱 。

9）3小時後 ，將容器轉移至-80℃冰箱並儲存過夜 。

10）第二天 ，將細胞放入液氮罐中的適當架子中 。

後凍結

11）從液氮罐中取出一個小瓶 ，並按照下麵的解凍複蘇程序測試凍存是否成功 。

複蘇程序 ：

1）從液氮罐中慢慢取出適當的托盤架 。取下長安全銷 ，從適當的托盤中取出一個小瓶 。

2）將托盤放回插槽中 ，然後將安全銷放回原位 。將托盤架再次送回液氮罐和蓋罐 。

3）在37°C水浴中快速解凍小瓶 ，直到隻剩下一小塊冰粒 。用乙醇噴灑小瓶，擦拭 ，並放入罩中 。

4）將小瓶（~1mL）的內容物吸移到T25燒瓶中 。

5）緩慢加入4mL冷培養基 ，每10秒鍾以約1滴的速度加入 ，偶爾旋轉 。再加入5mL培養基 。

6）將燒瓶放入適當的培養箱中 。

7）由於細胞凍存液含有二甲基亞碸（DMSO） ，6-12小時後將細胞分解並重懸於新T25培養瓶中的新鮮預熱培養基中 。