下麵的方案描述了細胞凍存方法的使用 ，其涉及-80℃超低溫冰箱用於冷凍保存細胞係 。ECACC通常使用可編程的速率控製冷凍機。這是凍存細胞最可靠和可重複的方法 ，但由於此類設備的成本超出了大多數研究實驗室 ，因此下麵的方法將詳細描述 。如果定期冷凍大量細胞培養物 ，則建議使用可編程的速率控製冷凍機 。

物料

• 細胞凍存液（通常為90％FBS ，10％DMSO或甘油

• 無菌水中70％的酒精

• 不含Ca2 + / Mg2 +的PBS

• HBSS中0.05％胰蛋白酶/ EDTA ，不含Ca2 + / Mg2 +

• DMSO

設備

• 個人防護設備（無菌手套 ，實驗室外套）

• 全臉防護麵罩/遮陽板

• 水浴溫度設定為37°C

• 微生物安全櫃在適當的安全殼水平

• 離心分離機

• 血細胞計數器

• 預先標記的安瓿/冷凍管

• 細胞凍存設備

• 關鍵點

• 最常用的冷凍保護劑是二甲基亞碸（DMSO） ，然而 ，這不適用於所有細胞係 ，例如HL60 ，其中DMSO用於誘導分化 。在這種情況下 ，應使用甘油等替代品（有關正確的冷凍保護劑的詳細信息 ，請參閱ECACC數據表） 。

• 上麵推薦的細胞凍存液已被證明是大多數細胞類型的良好通用培養基 。另一種常用的細胞凍存液配方是 ：70％基礎培養基 ，20％FBS ，10％DMSO ，但這可能不適用於所有細胞類型 。在定期使用之前 ，檢查它是否適用於您的細胞 。

• 文化是健康的並且處於生長的對數階段是至關重要的 。這可以通過使用預融合培養物（低於其最大細胞密度的培養物）和通過在冷凍前24小時更換培養基來實現 。

• 冷卻速率可以變化 ，但作為一般指導 ，-1℃至-3℃/分鍾的速率將證明適合於大多數細胞培養物 。

• 弗洛伊特先生係統的另一種選擇是Taylor Wharton被動式冷凍機 ，其中安瓿瓶內的杜瓦瓶中的液態氮蒸氣 。該係統允許安瓿逐漸降低 ，從而降低溫度 。速控冰櫃也是可用的 ，如果定期冷凍大量安瓿 ，它們特別有用 。

• 作為最後的手段 ，如果沒有其他裝置可用 ，可以將安瓿放在隔熱良好的盒子內（例如邊長至少1cm的聚苯乙烯盒子）並放置在-80℃過夜 。重要的是確保盒子在整個冷凍過程中保持直立 。冷凍後 ，應將安瓿轉移到液氮儲存容器的氣相中並記錄位置 。

• 如果使用涉及-80°C冰箱的冷凍方法 ，則必須為細胞係冷凍分配部分 ，以便不會無意中去除樣品 。如果這發生在冷凍過程的關鍵部分 ，那麽可行性和回收率將受到不利影響 。

• 程序

• 使用倒置顯微鏡觀察培養物以評估細胞密度並確認不存在細菌和真菌汙染物 。在對數生長階段收獲細胞 。對於貼壁細胞係 ，收獲細胞盡可能接近80-90％匯合 。

• 如前所述 ，使用胰蛋白酶/ EDTA將粘附和半粘附細胞懸浮於懸浮液中 ，並重新懸浮於至少相當於胰蛋白酶體積的一定體積的新鮮培養基中 。懸浮細胞係可以直接使用 。

• 取出一小部分細胞（100-200μl）並進行細胞計數 。理想地 ，細胞存活率應該超過90％ ，以便在冷凍後實現良好的恢複 。

• 將剩餘的培養物以150xg離心5分鍾 。

• 在細胞凍存液中以每毫升2-4×10 ^6個細胞的濃度重懸細胞 。

• 將1ml等份的細胞移液到已用細胞係名稱 ，傳代數 ，批號 ，細胞濃度和日期標記的冷凍保護安瓿中 。

• 將安瓿放入被動冷凍室 ，例如Nalgene先生Frosty冷凍容器 。用異丙醇填充冰箱並在-80℃下放置過夜 。

• 冷凍安瓿應轉移到液氮儲存容器的氣相中並記錄位置 。