目標

本實驗方案由歐洲認證細胞培養物典藏中心（ECACC ，英國公共衛生部的組成部分）推薦用於其細胞係的冷凍保存 。本實驗方案采用被動方法 ，包括-80°C電動冰櫃 ，用於細胞凍存液冷凍保存細胞培養物 。ECACC通常使用來自Planer Products公司的可編程速率可控冰櫃（Planer係列二） 。這是冷凍細胞的一種最可靠 、最可再現的方法 ，但由於此類設備的成本超出了大多數研究實驗室所能承受的範圍 ，因此下文將詳細描述其他一些方法 。如果需要定期冷凍大量細胞培養物 ，則建議使用可編程速率可控冰櫃 。

 材料

· 細胞凍存液（通常為70％基礎培養基 ，20％ FBS ，10％ DMSO）

· 70％乙醇水溶液

· PBS ，不含Ca²⁺ / Mg²⁺

· 0.25%胰蛋白酶 / EDTA ，溶於HBSS中 ，不含Ca²⁺/Mg²⁺

· DMSO

· 胰蛋白酶 / EDTA

· HL60

 設備

· 個人防護裝備（無菌手套 、實驗室工作服）

· 全臉保護麵罩 / 護目鏡

· 設置為37°C的水浴

· 適當密封水平的微生物安全櫃

· 離心機

· 血細胞計數器

· 預先貼好標簽的安瓿瓶 / 冷凍管

· 細胞冷凍裝置

 操作步驟

使用倒置顯微鏡觀察培養物 ，以評估細胞密集程度 ，並確認不存在細菌和真菌汙染物 。

用上述胰蛋白酶 / EDTA使貼壁和半貼壁細胞懸浮 ，並將其重懸於至少相當於胰蛋白酶體積的一定體積的新鮮培養基中 。懸浮細胞係可以直接使用 。取出一小部分細胞（100-200 μL）並進行細胞計數 。理想情況下 ，細胞活力應該超過90％才在冷凍後達到良好恢複 。將剩餘的培養物以150 g離心5分鍾 。

在細胞凍存液中以每毫升2-4×10⁶個細胞的濃度重懸細胞 。將1 ml 細胞等分移液到貼有標簽的冷凍安瓿瓶中 ，標簽須注明細胞係名稱 、傳代數 、細胞濃度和日期 。將安瓿瓶放入被動式冰櫃內 ，例如Nalgene Mr. Frosty。用異丙醇填充冰櫃 ，並設置為-80℃過夜。冷凍後的安瓿瓶應轉移到液氮儲存容器的氣相中並記錄位置 。

 重點

最常用的冷凍保護劑是二甲基亞碸 ，然而 ，它並不適用於所有細胞係 ，例如 ，HL60（產品編號 ：98070106-1v1-ECACC） ，其中的DMSO用於誘導分化 。在這種情況下 ，應使用甘油等替代品 。上麵推薦的ECACC細胞凍存液已被證明是適合大多數細胞類型的良好的通用培養基 。另一種常用的細胞凍存液配方是70％基礎培養基 ，20％ FBS ，10％ DMSO ，但這可能不適用於所有細胞類型 。在定期使用之前 ，檢查它是否適用於您的細胞 。至關重要的是 ，培養物必須是健康的，並處於生長的對數階段 。用預先匯合的培養物（低於其最大細胞密度的培養物） ，在冷凍之前24小時更換培養基 ，即可實現這種條件 。

冷卻速率可以改變 ，但一般原則是 ，每分鍾降低1℃至3℃被證明適合於大多數細胞培養物 。

Mr. Frosty係統的替代方案是Taylor Wharton被動式冰櫃 ，細胞凍存液這該係統中 ，安瓿瓶保存在杜瓦瓶頸的液氮蒸氣中 。該係統使安瓿瓶逐漸降低 ，溫度隨之而降低 。也有降溫速率可控的冰櫃 ，如果會定期冷凍大量安瓿瓶 ，這類冰櫃特別有用 。作為最後的手段 ，如果沒有任何其他設備可用 ，可以將安瓿瓶放置在隔熱良好的盒子內（例如壁厚至少1 cm的聚苯乙烯盒子） ，並置於-80℃下過夜 。重要的是必須確保盒子在整個冷凍過程中保持直立 。冷凍後的安瓿瓶應轉移到液氮儲存容器的氣相中並記錄位置。

如果使用涉及-80°C冰櫃的冷凍方法，則必須使用分配給細胞係冷凍的區域 ，這樣可避免樣品被無意中拿出 。如果這發生在冷凍的關鍵階段 ，細胞活力就會受到影響 。

 解決問題的建議

John Ryan博士
Corning Incorporated, Life Sciences
Acton, MA 01720

在解凍和接種培養物後 ，通常很快就注意到與冷凍儲存相關的存活率問題 。容易出問題四個主要方麵有 ：

1. 在收獲和處理細胞期間 。細胞過度暴露於解離劑 ，使用有毒的冷凍保護劑 ，或使高密度細胞懸液被長時間置於室溫下或在過於堿性的pH下 ，都可能造成問題 。

2. 在冷卻（冷凍）過程中 。細胞過度損傷和培養物活力降低 ，通常是由於使用過快或過慢的冷卻速率 ，或者由於冷卻過程暫時中斷 。不使用合適濃度的合適冷凍保護劑也會導致活力問題 。

3. 冷凍儲存期間 。如果小管在移入冰櫃的過程中受熱 ，或者冰櫃溫度沒有始終保持在適當的低溫溫度下 ，則通常會降低培養物活力 。

4. 在解凍和恢複期間 。如果解凍過程太慢或冷凍保護劑被不適當地除去 ，就會造成問題 。

這些活力問題通常可以借助以下技術發現冷凍過程中造成問題的環節，然後加以糾正 。收獲足夠的細胞 ，至少製備四小管 。然後取出一個細胞懸液樣品 ，其細胞數量等於將放入小管的細胞數 ，立即將其置於含有適量培養基的培養容器中並孵育 。該培養物將用作對照 ，以與其餘步驟中建立的培養物進行比較 。

接下來 ，將冷凍保護劑添加到剩餘的細胞中 ，並等分至三個小管中 。將一個小管置於4°C下1小時。然後從小管中取出細胞 ，好像它們剛剛從冰櫃中解凍一樣 ，然後如上所述接種在培養基中 。將該培養物與對照培養物進行比較 ，以確定是否存在與冷凍保護劑相關的任何問題。

同時 ，像往常一樣通過緩慢冷卻過程處理其餘的小管 。然後如上所述立即將一個小管瓶解凍並處理 。將該培養物與對照培養物進行比較 ，以確定是否存在與緩慢冷卻過程相關的任何問題 。

然後將其餘小管轉移到低溫冰櫃中儲存過夜 ，然後如上所述進行解凍和處理 。將該培養物與對照培養物進行比較 ，以確定是否存在與低溫儲存條件相關的任何問題 。如果有額外的細胞小管可用 ，應使用幾種不同的恢複技術來確定恢複技術是否是問題根源 。

通過將所有培養物與原始培養物進行比較 ，應該可以確定問題發生在冷凍過程的哪個階段 。知道後 ，細胞凍存液本指南及其參考文獻中提供的信息應足以消除問題 。