背景知識:

細胞培養的傳代及日常維持過程中,在培養器具 、培養液及各種準備工作方麵都需大裏的耗費 ，而且細胞一旦離開活體開始原代培養;它的各種生物特性都將逐漸發生變化並隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新變化 。因此及時進行細胞凍存十分必要 。細胞冷凍儲存在-70°C冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中 ，溫度達-196°C 。理論上儲存時間是無限的 。

原理:

細胞凍存及複蘇的基本原則是慢東快融 ，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力 。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞礬作保護劑 ，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性 ，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外 ，減少細胞內水晶的形成 ，從而減由於冰晶形誠造成的細胞損傷 。

複蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化 ，避免由於緩慢融化使水分參入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷 。

主體內容(操作步驟)

一 、材料

二 、(一)儀器

1. 淨化工作台

      2.離心機

      3.恒溫水浴箱

      4.冰箱(4C 、-20C 、-70C)

5.倒置相差顯微鏡

6.培養箱

7.液氮冰箱

(二)玻璃器皿

1.吸管(彎頭 、直頭)

        2.培養瓶,

        3.玻璃瓶(250ml 、100ml)

4.廢液缸

(三)塑料器皿

1.吸頭

      2.槍頭

3.膠塞

      4.移液管(10ml)

5.15m離心管

      6.凍存管(1~ 2ml)

(四) 其他物品

1. 微裏加樣槍

      2.紅血球計數板

3.記號筆

      4.醫用橡皮膏

5.移液槍

(五)試劑

1.D-Hanks液

      2.小牛血清
          

3.培養液

      4.雙抗(青黴素 、鏈黴素)

5.胰蛋白酶(0.08%)

6.1NHCI

      7.4%NaHCO3

      8.DMSO(分析屯)或無色新鮮甘油

二 、操作步驟(- )細胞凍存

      1.配製含10%DMSO或甘油 、10~ 20%小牛血清的凍存培養液;

      2. 取對數生長期的細胞 ，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來 ，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中 、:

      3.離心1000rpm, 5min;

      4.去除蛋白酶及舊的培養液 ，加入適裏製好的凍存培養液 ，用吸管輕輕吹打使細胞均勻 ，計數 ，調節凍存液中細胞的最終密度為5x 106ml~1X107 /mb

      5.將細胞分裝入凍存管中 ，每管1~15 mb

      6.在凍存管上標明細胞的名稱 ，凍存時間及操作者:

      7凍存:標準的東存程序為降溫速率1~-2C/min;當溫度達-25°C以下時 ，可增至-5°C-10°C/min;到-100°C時 ，則可迅速浸入液中 。也可將裝有細胞的東存管放入-20°C冰箱2h ，然後放入-70°C冰箱中過夜,取出凍存管 ，移入液氮容器內 。

(二)  細胞複蘇

      1.從液氮容器中取出凍存管 ，直接浸入37°C溫水中 ，並不時搖動令其盡快融化 。

      2從37°C水浴中取出凍存管 ，打開蓋子 ，用吸管吸出細胞懸液 ，加到離心管並商加10倍以上培養液 ，混勻;

      3.離心 ，1000rpm, 5min; 

      4棄去上清液 ，加入含10%小牛血清培養液重 懸細胞 ，計數 ，調整細胞密度 ，接種培養瓶 ，37°C培養箱靜置培養;

      5.次日更換一次培養液 ，繼續培養 。

三 、注意事項

      1.從增殖期形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用於凍存;但最好為對數生長期細胞 。在凍存前一天最好換次培養液;

      2.將凍存管放入液氮容器或從中取出時 ，要做好防護工作 ，以免凍傷; 3.凍存和複蘇最好用新製的培養液 。

四 、細胞複蘇

      在細胞複蘇過程中;有多次複蘇失敗 ，最終在查閱了相關技術積累了足夠的複蘇技能後複蘇成功 ，現將細胞複蘇的操作程序和主意事項總結如下 ，望能為同行提供些參考 。

{材料}
      1常規細胞培養儀器設備 、恒溫水浴振蕩器 。

      2培養液(DMEM)胎牛血清( CBS)二甲基亞礬( DMSO) 。

[操作程序]

      1細胞實驗室進行常規消毒,紫外照射40min 以上 。

      2培養液(DMEM) 、0.25%胰蛋白酶( Irypsin)恒溫水浴箱370C預熱20min,備用 。

3二甲基亞礬(DMSO)在4度冰箱中冷藏30min,備用 。

4從液氮保存罐中取出凍存管 ，立即放入40度水浴中 ，快速搖晃 ，直至凍存液完全融化 。

5將細胞懸液移入15ml離心管 ，緩慢加入4ml培養液 ，離心(000r min, 5min) 。

6用培養液縣液混懸沉澱細胞 ，調整細胞濃度 ，放培養箱中培養 。

7記錄複蘇日期 。

[注意事項]

1.取細胞的過程 中注意帶好防東手套,護目鏡 。此項尤為重要 ，細胞凍存管可能漏入液氮 ，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升 ，可導致爆炸 。

2.凍存液的問題:凍存液的強已是常識 ，在這裏不作詳述 ，但二甲基亞礬( DMSO)對細胞不是完全無毒副作用 ，在常溫下,甲基亞礬對細胞的毒副作較大 ，因此必須在 1-2min內使凍存夜完全融化o如果夏蘇溫度太慢 ，會造成細胞的損傷 ，二甲基亞礬( DMSO)最好選擇進口產品 。

3.離心前須加入少裏培養液 。細胞解凍後二甲基亞礬濃度較高 ，注意加入少裏培養液可稀釋其濃度 ，以減少對細胞的損傷 。

4.離心問題:目前主要有兩種見解 。-種是解凍後的細胞縣液直接吹打均勻後分裝到培養瓶中進行培養 ，第二天換液 。因為離心的目的是兩個 ，去除DMSO,去除死細胞 ，這個是標準流程 ，但對一般人來說 ，把握不好離心轉速和時間 ，轉的不夠活細胞沉底的少 ，細胞就全被扔掉了 ，轉過了活細胞會受壓過大 ，死亡 。此外在操作過程中容易汙染 ，所以不推薦 。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞礬( DMSO), DMSO對細胞有一定的毒副作用 ， 所以須將離心後的液體前倒爭 ，且定倒幹淨o我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行複蘇 ，結果無異常 。

5.細胞鐵壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解時1ml細胞夜要加10ml- 15m培養液 ，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附 。

6.複蘇細胞分裝的問題: 試驗中我的經驗總結為複蘇1管細胞一般可分裝到 1-2 隻培養瓶中 ，分裝過多 ，細胞衣度過低 ，不利於細胞的貼壁 。

7.加培養基的量放入問題:這個裏的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度 ，從如果你加培養基的太少 ，那麽DMSO的農度就會比較大 ，就會影細胞生長 ，從以前資料來看 ，DMSO的濃度在小於0.5%的時候對一般細胞沒有什麽影響 ，還有一個說法是1% 。所以如果你的凍存夜的農度是10% DMSO的話麽加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度 。