一年前 ，我凍存了一些含有10％DMSO和90％FBS的HUVEC(細胞凍存液) 。當解凍時 ，我將其置於水浴中直至大部分解凍 ，然後將溫熱的EGM-2加入到冷凍管中 ，然後轉移至含有幾毫升溫熱培養基的15mL Falcon 。然後我旋轉並重新懸浮並放入塗層的T-25但沒有附著細胞 。其他人如何凍存和複蘇HUVEC ？

這是尊龍凱時每天在實驗室中使用的步驟 。尊龍凱時使用Frosty先生的冷凍容器在-80°C冰箱中溫和冷凍細胞 。然後將冷凍的細胞轉移到液氮中儲存 。 

冷凍混合

•熱滅活的FCS（尊龍凱時使用來自Hyclone的FCS）含有10％DMSO（組織培養級 ，無菌） 。

•在4°C下保持無菌狀態 。

冷凍

•將Frosty先生的冷凍容器預先冷卻至4°C 。

•在冰上預冷冷凍介質 。每瓶需要~1毫升 。

•用HUVEC生長培養基平衡50ml管（HGM ：在尊龍凱時的情況下 ，來自Lonza的EGM-2 ，補充有FCS至18％終濃度FCS）至RT 。

•吸出培養基 ，衝洗1次RT PBS ，吸出然後胰蛋白酶消化細胞 。確保細胞已分離 。

•用HGM中和胰蛋白酶 。仔細但完全地重懸細胞 。

•將細胞懸浮液轉移至15 ml Falcon試管中 。

注意 ：尊龍凱時通常會冷凍含有~5 * 10 ^ 5個細胞的小瓶 ，因此我會在製粒前計算細胞數（為了粗略確定所需的冷凍混合量）細胞凍存液

•離心機中的沉澱細胞（室溫下5-7'150 g） 。

•吸出培養基並將顆粒放在冰上 。

•將冷凍介質加入顆粒中 。通過上下移液重新吸取 。 

•將細胞懸液分裝到冷凍瓶中 ，然後將瓶子轉移到Frosty先生身上 。

•將Frosty先生放在-80°C冰箱中 ，至少保存一夜 。

•將冷凍細胞轉移到液態N 2或低溫生物學設施 。

解凍

•準備一個塗有明膠或膠原蛋白的培養瓶 。我將含有500K細胞的小瓶放入T75燒瓶（約75cm 2表麵）中 。

•準備1管12毫升HGM ，並在37°C溫暖 。

• 在37°C的水浴中從液態N 2中解凍1瓶HUVEC  。

•當細胞懸浮液幾乎但未完全解凍時 ，將其與12 ml HGM一起從水浴中取出 ，並用70％乙醇噴霧小瓶和試管 。

•放入組織培養罩並擦去多餘的乙醇 。

•將樣品瓶的內容轉移到HGM 。

•轉移到明膠/膠原蛋白塗層燒瓶中 。 

•將燒瓶放入37°C ，5％CO 2培養箱中 。在一天結束時更換培養基以從冷凍混合物和未附著的細胞（不是很多）中去除DMSO 。 細胞凍存液

上述的步驟很繁瑣 ，也很古老

 如果使用HAKATA無血清細胞凍存液 ，那麽你隻需要將凍存液從4°C冰箱中取出來使用 ，

凍存管直接放於-80°C過夜 ，在轉移隻液氮中就可以了 。