我正麵臨凍存貼壁細胞（HepG2和HUCCT1）的問題 。我不知道如何凍存和複蘇的方法

在我開始新的培養後 ，細胞不會附著在培養皿上 。他們可能已經死了 ！

誰能告訴我一個好的細胞凍存/細胞複蘇 ？

一般而言，當您製作細胞庫/冷凍細胞時 ，您應用的原則似乎適用於大多數哺乳動物細胞培養係統 。我必須承認 ，900 uL血清和100 uL DMSO過量 ，但您正在應用90％血清和10％DMSO 細胞凍存液 ，這很好 。

正如一些人已經評論過的 ，一些實驗室使用不同的冷凍培養基混合物 ，如70％培養基 ，20％血清和10％DMSO 。這就是我用於哺乳動物細胞培養的方法 。但考慮到你的冷凍媒體似乎沒有明顯的問題 ，我建議你看看早期的部分 。

這樣的部分將是 ：細胞傳代數（你決定用它來創建你的細胞庫 - 通常是第7-9段是最好的細胞培養物使用 ，而大多數細胞超過20次傳代應該被丟棄） ，細胞密度/ mL（標準通常> 1,000,000 / mL） ，前的任何明顯汙染 ，冷凍培養基中使用的血清年齡 ，所用血清的來源（血清從原產地到同一來源的均勻分批變化很大） ，冷凍機製（使用慢速冷凍 - 先生Freezey iso-proponal冷凍裝置） ，最後你的解凍方案 。

任何標準解凍方案應該在37℃解凍時快速進行 ，然後進行初始平板加上使用的解凍培養基 。我將解凍的細胞在80％培養基+ 20％血清（無抗生素）中培養2小時 。然後用溫PBS（不含Mg2 +或Ca2 +）徹底洗滌以除去DMSO ，然後加入更多的解凍培養基孵育24小時 。在此之後 ，您應該將介質更換為正常的培養基 ，在第一次通過前離開24-48小時 。

我的正常程序是使用HAKATA無血清細胞凍存液

移液到冷凍管 ，快速工作 。

接下來 ，直接凍存 ：直接放置在-80℃冰箱中 。然後根據需要轉移到液氮中 。

為了解凍 ，在37℃浴中快速加熱 ，轉移到管中 ，慢慢加入培養基 ，直到你有你想要的體積  。我第二天更換了培養基 ，但是對於一些細胞 ，最好立即離心並更換培養基 。

編輯 ：坦率地說 ，回顧過去 ，這種方法是導師教給我的方法 ，但我沒有強有力的證據表明這一點至關重要 。我總是這樣做 ，結果很好 ，所以我堅持下去 。