複蘇步驟

一.實驗前準備 ：

將水浴鍋預熱至37℃ 。

細胞實驗室進行常規消毒 ，用75％酒精擦拭並且使用紫外線照射40min的超淨工作台台麵 。

在超淨工作台中按次序擺放好消過毒的離心管 、吸管 、培養瓶等 。

二．取出凍存管 ：

根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號 。

從液氮罐中取出細胞盒 ，取出所需的細胞 ，同時核對管外的編號 。

三．迅速解凍 ：

迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍 ，並要不斷地搖動 ，使管中的液體迅速融化 。

約1-2min後凍存管內液體完全溶解 ，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁 ，再拿入超淨台內 。

四.平衡離心 ：

用架盤天平平衡後 ，放入離心機中1000r/min ，離心5min 。

五.製備細胞懸液 ：

吸棄上清液 。

向離心管內加入10ml預熱的培養液 ，吹打製成細胞懸液 。

用培養液懸液混懸沉澱細胞 ，調整細胞濃度 ，放培養箱中培養 。

六.細胞計數 ：

細胞濃度以5×105/ml為宜 。

七.培養細胞 ：

將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內 ，將培養瓶放入37℃ ，5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）後換液繼續培養 ，換液的時間由細胞情況而定 。

八. 記錄複蘇日期 ：

細胞凍存和複蘇是細胞培養技術裏麵容易出問題的部分 ，因此必須注意以下幾點~

注意無菌操作 。

取細胞的過程中可能會接觸液氮 ，一定注意帶好防凍手套 ，護目鏡 。

此項尤為重要 ，如果凍存管密封不嚴 ，細胞凍存管可能漏入液氮 ，解凍時 ，在水浴中搖晃 ，凍存管中的氣溫急劇上升 ，可導致爆炸 ，所以 ，一定要戴保護眼鏡和手套 ，複蘇過程中應蓋上恒溫水浴鍋的蓋 。

應在1-2min內使凍存液完全融化 。如果複溫速度太慢 ，則會造成細胞損傷 。另外 ，細胞複蘇後的操作Hao在4℃冰浴中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性 。

細胞複蘇過程中 ，升溫的速率要大 ，把從液氮取出的細胞在短的時間內放入水浴鍋 。

離心前須加入少量培養液 。細胞解凍後二甲基亞碸濃度較高 ，注意加入少量培養液可稀釋其濃度 ，以減少對細胞的損傷 。

細胞貼壁少的問題 ：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15ml培養液 ，經驗總結 ，培養基越少細胞越容易貼附 。

複蘇細胞分裝的問題 ：複蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2隻培養瓶中 ，分裝過多 ，細胞濃度過低 ，不利於細胞的貼壁 。

加培養基的量放入問題 ：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度 ，從如果加培養基的太少 ，DMSO的濃度就會比較大 ，就會影響細胞生長 ，從以前的資料來看 ，DMSO的濃度在小於0.5%的時候對一般細胞沒有什麽影響 。還有一個說法是1％ 。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO ，那麽加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度 。    

初學者易犯的錯誤 ：

水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃直接融化 。

水浴鍋內凍存管太多 ，導致傳熱不佳 ，使融化時間延長 。

離心前忘記平衡 ，導致離心機損壞和細胞丟失 。

一次複蘇細胞種類過多 ，忘記更換吸頭和吸管 ，導致細胞交叉汙染 。

 解凍後的細胞要用和以前一樣的培養液和血清 。因為每一種細胞都有自己特定的 ，並且已經熟悉了的生長環境 。突然使用不一樣的培養液和血清 ，會造成細胞生長不良 ，甚至死亡 ，像水土不服一樣 。

結果分析 ：

判斷細胞複蘇成功與否 ，需要看複蘇後細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩餘的細胞 ，用台盼藍染色法檢測複蘇細胞的存活率 。呈藍色的細胞為死細胞 ，活細胞不著色 。用細胞計數板和計數器計數細胞 ，得出細胞存活率） 。如果複蘇後95%以上的細胞貼壁 ，而且細胞的活性好 ，這就說明細胞複蘇的過程沒有問題 。複蘇的細胞恢複到正常生長 ，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）後要再凍存以補充細胞儲存數量 。